Die Aussaat

1. Einleitung

Die asymbiotische Aussaat ist eine künstliche Keimmethode für Orchideensamen, die ohne die natürliche Symbiose mit Mykorrhizapilzen auskommt. Während Orchideensamen in der Natur extrem geringe Keimraten haben, ermöglicht die sterile Kultur auf Nährmedien eine kontrollierte, erfolgreiche Keimung.
Diese Methode wird sowohl von professionellen Laboren als auch von Hobbyisten genutzt, um seltene oder empfindliche Arten zu vermehren. Die Zucht von Mexipedium xerophyticum gilt dabei als recht anspruchsvoll und wird nur von ganz wenigen Züchtern praktiziert. Es wird auch berichtet, dass alleine schon die Samenproduktion eine Herausforderung ist. Diese Erfahrungen machten wir bisher nicht, obschon regelmässig leere Kapseln zu beobachten sind.

Der hier beschriebene Prozess beschreibt die Aussaat von Mexipedium xerophyticum aus der grünen, noch ungeöffneten Kapsel. Wenn immer möglich ist diese Methode der Aussaat von Samen aus der trockenen, geöffneten Kapsel vorzuziehen.

Samenkapseln von Mexipedium xerophyticum. Schon jetzt erkennt man, dass zwei der Kapseln vermutlich keine fertilen Samen enthalten.

2. Benötigte Materialien

 Bevor du beginnst, stelle sicher, dass du alle Materialien vorbereitet hast.

2.1. Geräte

  • Sterile Werkbank mit HEPA-Filter (Alternativen gibt es für den Hobbybereich)
  • Autoklav oder Druckkochtopf zur Sterilisation
  • Gläser, Schraubgefässe oder Kulturflaschen (z. B. Babygläschen)
  • Pinzette, Skalpell, Löffel und Spatel
  • Sprühflasche mit Alkohol (70% Ethanol oder Isopropanol)
  • Präzisionswaage
  • pH-Meter oder pH-Teststreifen (ersterer ist definitiv vorzuziehen)
  • Messbecher
  • Kochtopf und Herd zur Herstellung des Nährmediums
  • Glaskugel- oder Infrarotsterilisator
  • Labor-Werkzeugständer
  • Rolle Kunststofffolie zum Abdichten der Aussaatgefässe
Materialien und Geräte zur Aussaat von Orchideensamen

2.2. Chemikalien


Die folgenden Chemikalien werden während des Aussaatprozesses benötigt:

  • Desinfektionsmittel zur oberflächlichen Sterilisation der Samenkapsel (z. B. 10%ige Haushaltsbleiche (Javel) mit einem Tropfen Spülmittel)
  • Ethylalkohol (Ethanol) 70% zur Flächendesinfektion
  • NaOH (Natronlauge) für die Erhöhung des pH-Wertes
  • HCl (Salzsäure) für die Senkung des pH-Wertes
  • Murashige & Skoog (MS) Medium, Pulver zur Nährbodenherstellung für die Orchideenaussaat

2.3. Nährmedium

Nach unzähligen Versuchen mit verschiedenen Nährmedien und organischen Zusätzen hat sich herausgestellt, dass für das erfolgreiche Wachstum von Mexipedium xerophyticum Kokosnusswasser ein essenzieller Bestandteil ist.  Seit wir mit Mexipedium züchten haben wir die Kokoswasser-Konzentration variiert und sind zum Schluss gekommen, dass ein optimales Wachstum mit 10% erreicht werden kann. Diese Konzentration hat sich sowohl für die Aussaat, als auch für das Umlegen bewährt. Wir haben auch Experimente mit Konzentrationen bis 30% Volumenanteil des Mediums durchgeführt. Nach anfänglich guter Keimrate sterben die Protokorme jedoch schon bald ab.

Generell ist es einfach, Mexipedium xerophyticum zum keimen zu bringen. Das weitere Wachstum ist jedoch schwierig und nur auf perfekt abgestimmten Nährmedien erfolgreich.

Zusätzlich zu Kokosnusswasser haben wir auch Experimente mit Ananassaft und homogenisierter Banane durchgeführt (siehe Foto unten). Auch die Zuckerkonzentration haben wir variiert. Es hat sich herausgestellt, dass sämtliche organischen Zusätze (mit Ausnahme von Kokosnusswasser) einen negativen Effekt auf das Wachstum der Jungpflanzen haben, unabhängig von deren Konzentration. Auf die Keimung selbst hatten sie keinen Einfluss.

Für Mexipedium xerophyticum hat sich für uns folgender Nährboden bewährt:

Zusammensetzung 1000ml Nährboden (Aussaat) Menge
Agar-Agar
7g
MS Medium (1/2 Konzentration)
2.3g
Kokoswasser
100ml
Saccharose
12g
Aktivkohle
2g
Destilliertes Wasser
900ml
HCl / NaOH
pH: 5.8 – 6.0
Das MS-Medium (nach Murashige & Skoog) ist eines der bekanntesten Nährmedien für die Orchideenzucht.
Experiment: 6 Monate alte Jungpflanzen, links auf 1/2 MS, 10% Kokoswasser und 5% Ananassaft. Rechts dieselbe Rezeptur ohne Ananassaft.

 

3. Vorbereitung des Nährmediums

Das Nährmedium dient den Keimlingen als alleinige Nährstoffquelle. Die Kulturgefässe werden wir folgt vorbereitet:

  1. Agar in einem Becher mit einem Teil des zur Verfügung stehenden destillierten Wassers auflösen. Später löst er sich besser in der heissen Nährlösung, wenn er vorgängig schon in kalter Flüssigkeit gelöst wurde.
  2. Restliche Flüssigkeiten in Gefäss geben und aufkochen.
  3. MS Medium hinzugeben.
  4. Agar-Agar hinzugenben.
  5. pH-Wert einstellen: Ziel: pH 5,8–6,0. (HCl senkt den pH, NaOH erhöht ihn). Zu beachten ist, dass Kokosnusswasser und Ananassaft natürlicherweise viel Säure enthalten, weshalb die Korrektur des pH-Wertes sehr wichtig ist.
  6. Das heisse Medium in sterilisierbare Behälter füllen (Glas, Polypropylen o.ä.).
  7. Behälter locker verschliessen, dann 20–25 Minuten im Autoklav bzw. Druckkocher bei 121 °C sterilisieren.
  8. Nach dem Sterilisieren schnell verschliessen und abkühlen lassen.
  9. Den Spalt zwischen Deckel und Gefäss mit Kunststofffolie (z.B. Frischhaltefolie) abdichten.

4. Vorbereitung der Samenkapsel

Verwende nur reife, aber unbeschädigte Samenkapseln. Der beste Zeitpunkt ist kurz bevor die Kapsel natürlich aufspringt. Bei Mexipedium xerophyticum sind die Kapseln nach ca. 6 Monaten reif. Die restliche Zeit benötigen sie lediglich, um zu trocknen und aufzuplatzen. Wenn immer möglich ist die Aussaat von Samen aus der grünen Kapsel derjenigen aus der aufgeplatzten Kapsel vorzuziehen. Das Vorgehen zur Sterilisation der Samenkapsel ist wie folgt:
  1. Kapsel in Bleichelösung (10 % mit 1 Tropfen Spülmittel) 15 Minuten einlegen und regelmässig schütteln.
  2. Kapsel gründlich mit sterilem, destilliertem Wasser abspülen.
  3. Unter sterilen Bedingungen aufschneiden und die Samen direkt entnehmen.
Bemerkungen: Natriumhypochlorit (NaOCl) wird in verschiedenen Konzentrationen verkauft, wobei Haushaltsbleiche typischerweise 5–6 % enthält. Eine 10%ige Lösung davon bedeutet somit, dass in der fertigen Bleichelösung für die Samen- und Kapseldesinfektion von Orchideen ca. 0,5–0,6 % NaOCl enthalten sind. Mit dieser Konzentration arbeiten auch viele Labore. Im Labor kommt anstatt Spülmittel meist Tween 20 in einer Konzentration von 1 Tropfen auf 100 ml Bleichelösung zum Einsatz. Spülmittel in derselben Konzentration funktioniert jedoch genauso gut.
 

5. Vorbereitung der sterilen Werkbank

Die größte Gefahr bei der In-vitro-Aussaat sind Schimmelpilze und Bakterien. Um steril arbeiten zu können, kommt man früher oder später nicht um die Verwendung einer Sterilen Werkbank herum. Dieses Laborgerät wurde speziell für diese Art von Arbeiten konzipiert. Wir verwenden für unsere Arbeiten eine Sterile Werkbank, die zusätzlich mit UV-Licht ausgestattet ist. Die Vorbereitungsarbeit läuft wie folgt ab:
  1. UV-Lampe einschalten (typischerweise 15–30 Minuten, gemäss Herstellerangaben). Währenddessen keine Arbeiten durchführen.
  2. UV ausschalten, Werkbank öffnen.
  3. Luftstrom aktivieren.
  4. 10 Minuten vorlaufen lassen, damit Partikel aus dem Arbeitsbereich gespült werden.
  5. Arbeitsfläche, Seitenwände und Scheibe mit 70 % Ethanol oder Isopropanol abwischen. Von oben nach unten und von hinten nach vorne wischen. Saubere, fusselfreie Tücher verwenden.
  6. Materialien einbringen. Nur notwendige, saubere/sterile Materialien in die Werkbank stellen. Die Oberflächen sämtlicher Materialien sind vor dem Einbringen zu desinfizieren. Dafür wird in der Regel ebenfalls Ethanol bzw. Isopropanol verwendet.
  7. Nach 20 Minuten ist die Sterile Werkbank vorbereitet und es kann mit der Arbeit begonnen werden.
Hinweis: UV ersetzt nicht die chemische Desinfektion; sie ist eine zusätzliche Massnahme.

6. Aussaat auf das Nährmedium

Sobald Samen und Gläser steril sind, kann die eigentliche Aussaat beginnen:

  1. Glasunterlage mit Ethanol oder Isopropanol abwischen.
  2. Sämtliches Werkzeug wird von nun an vor dem Kontakt mit dem organischen Material erhitzt (Kugel- oder Infrarotsterilisator).
  3. Samenkapsel mit Pinzette auf Glasunterlage legen und mit Skalpell aufschneiden.
  4. Aussaatgefäss öffnen und Deckel mit der Öffnung nach oben ablegen.
  5. Samen dünn und gleichmässig über die Agaroberfläche verteilen.
  6. Deckel sofort wieder schliessen.

Wichtig: Samen dürfen nicht unter das Medium gedrückt werden; sie liegen nur oben auf.

Mexipedium xerophyticum Samen
Die Samen von Mexipedium xerophyticum sind schwarz und winzig klein (Grössenvergleich mit 1 Schweizer Franken).

6.1. Nach der Aussaat

Sind sämtliche Aussaaten erledigt, werden die Gefässe noch in der Werkbank mit Kunststoffolie abgedichtet und ggf. beschriftet, falls dies nicht schon geschehen ist. Dabei ist nicht nur die Information zur Kreuzung, sondern auch das Aussaatdatum von grosser Wichtigkeit. Die Gläser werden an einem warmen Ort bei 22–24 °C aufgestellt. Die Temperatur sollte dabei so wenig schwanken wie möglich. Wir haben die Erfahrung gemacht, dass die Protokorme bei Mexipedium xerophyticum grösser werden, wenn die Keimung im Dunkeln erfolgt. Der Unterschied zu im Licht gekeimten Sämlingen ist aber fast vernachlässigbar, weshalb wir sie normalerweise von Anfang an zu den anderen Aussaatgefässen stellen. Besonders wichtig ist an der Stelle zu erwähnen, dass die Protokorme und Jungpflanzen sehr anfällig für zu hohe Temperaturen sind. Es ist deshalb essenziell, dass das Thermometer möglichst zu keiner Zeit über 28 °C ansteigt. Spezialisierte Orchideenlabore haben in der Vergangenheit schon ihre gesamten Aussaatgefässe mit Mexipedium xerophyticum aufgrund von zu hohen Temperaturen verloren!

7. Keimung und Pflege der Protokorme

Die ersten Keimlinge erscheinen nach etwa 2 Wochen.

7.1. Entwicklungsphasen

 
  1. Quellungsphase: Der Embryo nimmt Feuchtigkeit auf. (ab Tag 1)
  2. Aufreissen der Testa: Der Embryo quillt so stark auf, dass er die Testa (Samenhülle) aufreisst. (ca. 5-10 Tagen nach der Aussaat)
  3. Protokormbildung: Der Embryo entwickelt sich zu einem undifferenzierten Zellkügelchen, dem sogenannten Protokorm. (ca. 10-15 Tagen nach der Aussaat)
  4. Differenzierungsphase: Der Keimling bildet die Blattanlagen aus und nimmt Nährstoffe und Wasser mithilfe der Rhizoide (Vorstufe der Wurzeln) auf. (ca. 2 Monate nach der Aussaat)
  5. Wurzelbildung: Die ersten Wurzelspitzen erscheinen und verankern den Sämling im Nährmedium. (ca. 5 Monate nach der Aussaat)
  6. Wachstumsphase: Die Entwicklung der Jungpflanze schreitet voran und es bilden sich laufend neue Wurzeln und Blätter. (pikierfähig nach ca. 2 Jahren)
Schematische Darstellung der Entwicklungsphasen von Mexipedium xerophyticum vom Samen bis zur pikierfähigen Jungpflanze.

7.2. Wachstumsbedingungen der Protokorme

Wie schon oben beschrieben können die Kulturgefässe von Anfang an ans Licht gestellt werden, weil kaum Unterschiede zu im Dunkeln gekeimten Sämlingen zu erkennen sind. Falls man sich dennoch für die Dunkelkeimung entscheidet, werden die Gefässe ans Licht gestellt, nachdem sich die Samen mehrheitlich in Protokorme verwandelt haben. Dies geschieht nach ungefähr 6 Wochen. Schnell setzt die Chlorophyllbildung ein und die Protokorme werden innert Wochenfrist grün.
Mexipedium xerophyticum Keimlinge
Schon 12 Tage nach der Aussaat ist zu erkennen, wie die Testa (Samenschale aus abgstorbenen Zellen) aufreisst und der Embryo anschwillt.
Nach 45 Tagen sind die Protokorme ergrünt und zeigen erste Ansätze von Blattanlagen.

7.3. Wann umlegen?

Nach etwa 4-5 Monaten werden die Keimlinge erstmals umgelegt. Die Pflänzchen werden bereits damit begonnen haben, die ersten Blätter zu bilden. Das Umlegen auf neues Nährmedium bringt den Vorteil mit sich, dass der Abstand der Keimlinge zueinander vergrössert werden kann und die Nährstoffversorgung und Beleuchtung damit besser wird.

8. Umlegen auf frisches Medium

Das Umlegen auf neues Medium erfolgt bei Mexipedium xerophyticum unserer Erfahrung nach am Besten auf denselben Nährboden wie bei der Aussaat. Anders als bei anderen Frauenschuh-Arten hatte homogenisierte Banane in allen Konzentrationen einen negativen Einfluss auf die Entwicklung der Jungpflanzen. Auch andere organische Zusätze wie Ananassaft hatten keinen positiven Einfluss auf die Entwicklung der Jungpflanzen oder hemmten sie sogar.

Zusammensetzung 1000ml Nährboden (Aussaat) Menge
Agar-Agar
7g
MS Medium (1/2 Konzentration)
2.3g
Kokoswasser
100ml
Saccharose
12g
Aktivkohle
2g
Destilliertes Wasser
900ml
HCl / NaOH
pH: 5.8 – 6.0
Nach 5 Monaten wurden diese Jungpflanzen erstmals umgelegt. Diese Aufnahme wurde ein Monat später gemacht.

8.1. Ablauf des Umlegens

  1. Wieder steril arbeiten.
  2. Jungpflanzen mit einem sterilen Spatel oder später auch einer langen Pinzette vorsichtig aus dem Glas lösen. Wir verwenden dafür eine Dennerle Pflanzenpinzette XL, weil sie eine hochwertige Metalloberfläche und einen angenehmen Druckwiderstand hat.
  3. Auf ein frisches Medium setzen, genügend Abstand lassen. Falls Wurzeln vorhanden sind, diese möglichst in Kontakt mit dem Nährboden bringen.
  4. Glas wieder verschliessen, mit Frischhaltefolie abdichten und weiterkultivieren.

9. Pikieren

Nach etwa zwei Jahren sind die Pflanzen gross genug, um sie aus den Kulturgefässen zu nehmen und zu pikieren.

9.1. Vorbereitung der Kulturgefässe

Die Wahl der Kunststoffgefässe ist Geschmackssache. Viel wichtiger ist dabei die Erdmischung:

Feine Pinienrinde + Perlit + etwas Sphagnum.

Tipp: Auf der Erdoberfläche sollte eine dünne Schicht Sphagnum liegen, um die Basis der Jungpflanzen feucht zu halten.

9.2. Schrittweise Vorgehensweise

 
  1. Pflanzen aus dem Glas nehmen und alle Agarreste gründlich unter fliessendem Wasser auswaschen. Die Wurzeln sollten dabei möglichst nicht beschädigt werden. Es ist stets besser, etwas Medium an den Wurzeln zu lassen, als die Pflanzen allzu gründlich reinigen zu wollen.
  2. In Gemeinschaftstopf setzen.
  3. Dünne Schicht Sphagnum nach dem Pikieren aller Sämlinge auf der Substratoberfläche aufbringen.
  4. Für die ersten Wochen für hohe Luftfeuchtigkeit sorgen. Die Luftbewegung ist dabei äusserst wichtig, um Krankheiten vorzubeugen.
  5. Wenn die Pflanzen ausreichend angewurzelt sind, vertragen sie auch eine niedrigere Luftfeuchtigkeit.
Bemerkung: In dieser Phase wachsen die Jungpflanzen von Mexipedium xerophyticum im direkten Vergleich zu anderen Frauenschuhorchideen ausserordentlich langsam. Das ist normal.

10. Häufige Probleme und Lösungen

10.1. Schimmel im Glas

Ursache: Unzureichende Sterilität.
Lösung: Glas entsorgen; Ursachenanalyse durchführen.

10.2. Trüber Film auf der Oberfläche des Mediums

Ursache: Bakterienwachstum: Unzureichende Sterilität.
Lösung: Glas entsorgen; Ursachenanalyse durchführen.
Alternative: Aufgrund der Seltenheit der Art kann versucht werden, die Jungpflanzen zu retten. Dies hat bei unseren eigenen Versuchen gar nicht so schlecht funktioniert. Dazu werden die Jungpflanzen min. 30 Minuten in eine Desinfektionslösung (10%ige Haushaltsbleiche/Javel mit einem Tropfen Spülmittel) getaucht und regelmässig geschüttelt. Danach können die Pflanzen (ohne Abspülen mit sterilem destilliertem Wasser) auf ein neues Medium übertragen werden. Diese Behandlung ist nicht besonders schonend für die Pflanzen und einige werden dabei eingehen, aber ein erstaunlich grosser Anteil überlebt diese Massnahme. Dadurch, dass das Desinfektionsmittel an den Jungpflanzen verbleibt, ist es nachhaltig wirksam gegen alle Arten von Keimen, die sich noch an den kontaminierten Pflanzenteilen befinden könnten.

10.3. Keine Keimung

Ursache Möglichkeit 1: Samen möglicherweise tot bzw. nicht fertil.
Lösung: Abwarten und Glas nach 1 Jahr entsorgen. Die Wahrscheinlichkeit, dass dann noch etwas keimt, geht gegen null.

Ursache Möglichkeit 2: pH-Wert fehlerhaft.
Lösung: pH-Wert genau feststellen, bevor weitergefahren wird.

Ursache Möglichkeit 3: Unpassende Wachstumsbedingungen.
Lösung: Wachstumsbedingungen genau überwachen. Die Temperatur ist besonders wichtig (Minimum-Maximum-Thermometer).

10.4. Wachstumsstillstand

Ursache: Medium verbraucht.
Lösung: Umlegen notwendig.

Ursache: Unpassende Wachstumsbedingungen.
Lösung: Wachstumsbedingungen genau überwachen. Besonders kritisch sind bei Mexipedium xerophyticum zu hohe Temperaturen. Diese sollten 28 °C möglichst nie übersteigen, auch nicht kurzfristig!

10.5. Ausbleichen der Protokorme

Ursache 1: Falsches Medium.
Lösung: Oben beschriebenes Medium verwenden. Mexipedium xerophyticum ist sehr wählerisch, was das Medium und vor allem die organischen Zusätze angeht. Die Samen zum Keimen zu bringen ist zwar in der Regel sehr einfach, sie danach aber zum Wachsen zu bringen, stellt eine Herausforderung dar.

Ursache 2: Falsche Temperatur.
Lösung: Die Keimlinge im Glas sind verhältnismässig empfindlich auf zu hohe Temperaturen. Temperaturspitzen über 30 °C quittiert Mexipedium xerophyticum mit dem Absterben einzelner Protokorme, bis hin zum Totalverlust.

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